Modelli tridimensionali
Modelli tridimensionali di Cellule endoteliali (CE) e Cellule Muscolari Lisce (CML) di arteria coronarica ottenuti da osservazioni al microscopio a fluorescenza e microscopio confocale.
​
I seguenti modelli sono ottenuti mediante l'elaborazione di immagini derivanti da microscopio a fluorescenza e da microscopio confocale. L'acquisizione di una serie di immagini variando la distanza di messa a fuoco sull'asse Z di un campione di cellule (Z-Stack) consente di ricrearne la superficie tridimensionale e di visualizzarla in maniera interattiva. Alcuni test sono stati effettuati anche utilizzando una sola immagine per valutarne l'efficacia.
​
La parete di un vaso è composta da due principali componenti cellulari: le cellule endoteliali (CE) e le cellule muscolari lisce (CML) e da componenti prodotti da esse, come elastina e collagene, che vanno a formare la matrice extracellulare (MEC). L'interazione di tutti i componenti della parete è necessaria per un corretto funzionamento dei vasi sanguigni.
Per l'osservazione le cellule vengono isolate dalle arterie e coltivate in vitro in condizioni standard e cioè in presenza di siero bovino, necessario perché si dividano e crescano; le cellule abbandonano la quiescienza e cominciano a dividersi e migrare, diventano sintetiche, attivate evidentemente da fattori e ormoni presenti nel siero.
​
La particolare colorazione dei modelli è data dalla reazione alla luce di appositi marcatori che vengono somministrati alle cellule: il DAPI e la FALLOIDINA. In blu si colorano i nuclei delle cellule utilizzando il DAPI; in verde sono colorati i filamenti di actina grazie alla Falloidina. I filamenti di actina sono strutture proteiche che fanno parte del citoscheletro della cellula. Il citoscheletro (come dice il nome: scheletro della cellula) è una rete complessa di filamenti e tubuli che contribuisce al sostegno interno della cellula e ne determina caratteristiche importanti come la struttura, la flessibilità, la capacità di muoversi e contrarsi.
DAPI: composto chimico (4’6-diamidin-2-fenilindolo) è un colorante organico fluorescente che si lega a regioni del DNA ricche in sequenze particolari (A-T) colorando in blu i nuclei.
FALLOIDINA: una tossina presente in alcuni funghi velenosi (Amanita phalloides) che si lega ai filamenti di actina e li stabilizza. Resa fluorescente è utilizzata per visualizzare questi filamenti all’interno delle cellule.
Microscopio confocale - Z-Stack
Cellule endoteliali di arteria coronarica (CE)
Le cellule endoteliali rivestono le pareti dell’interno dei vasi, costituiscono quindi una barriera fisica tra il lume del vaso, ma sono anche una importante interfaccia biologica capace di rispondere a segnali chimici e meccanici. Dal punto di vista morfologico costituiscono un unico strato di cellule appiattite dalla forma poligonale. Assolvono a diverse funzioni importanti quali: regolazione della permeabilità vasale, del tono dei vasi, della loro omeostasi, dell’infiammazione (reclutamento dei neutrofili) e dell’emostasi.
​
​
OFF
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML): fenotipo contrattile
Cellule coltivate in assenza di siero per 3 giorni, contrattili, fusiformi, aspetto più simile al fisiologico.
​
Le Cellule Muscolari Lisce (CML) costituiscono la componete cellulare prevalente della parete arteriosa e quella indispensabile per un buon funzionamento dei vasi in quanto sono responsabili del tono vascolare: rilassandosi e contraendosi possono modificare il diametro del lume permettendo il fluire del sangue.
Caratteristica peculiare e molto interessante di queste cellule è che sono in grado di cambiare aspetto (morfologia si dice) e funzioni in risposta a stimoli esterni di tipo ormonale, chimico o meccanico: si parla di cambiamento fenotipico. Nei vasi “normali”, sani, in condizioni che definiamo “fisiologiche”, le CML hanno un fenotipo così detto “contrattile” e il nome definisce la funzione di queste cellule. Il loro aspetto è fusiforme e allungato con le due estremità più sottili e la parte centrale in cui si dispone il nucleo più allargata. Sono cellule quiescenti, nel senso che non si dividono, e sono caratterizzate dalla presenza di abbondanti fibre contrattili ricche di proteine specifiche come l’alfa actina e alcune isoforme della miosina (SM1 e SM2). Sono qualificate nella loro funzione di contrattilità, sintetizzano le proteine necessarie per esplicare questo compito e il loro metabolismo è focalizzato sulla produzione dell’energia necessaria per l’apparato contrattile. Le CML contrattili sono quindi cellule differenziate, cioè mature e altamente specializzate, ma mantengono una grande plasticità e cioè la capacità di de-differenziare e modulare il fenotipo.
​
​
ON
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML): fenotipo sintetico o attivato
Cellule coltivate con siero, migranti e proliferanti
In seguito all’attivazione delle cellule endoteliali, a infiltrazione di monociti in un ambiente pro-infiammatorio e ipercolesterolemico e attivate da stimoli esterni le cellule muscolari assumono il fenotipo detto “sintetico” che possiamo anche definire patologico in quanto questo cambiamento accompagna l’insorgenza e il successivo sviluppo di patologie cardiovascolari. Le CML sintetiche sono caratterizzate da una drastica riduzione dell’apparato contrattile, mentre aumentano le strutture e gli organelli impegnati nella sintesi proteica (da cui il nome). Acquisiscono le capacità di crescere, dividersi e di migrare e andranno a costituire le placche aterosclerotiche. Il loro aspetto si modifica drasticamente, perdono la caratteristica forma a fuso, diventano più allargate e spesso assumono una morfologia a ventaglio, con la parte più larga (che è quella frontale) caratterizzata da strutture specializzate nella migrazione cellulare: pseudopodi, lamellipodi e filopodi. L’etimologia di questi nomi (pseudo significa falso e podos piede) è molto interessante ed esprime perfettamente la funzione: sono infatti dei finti piedi che aiutano la cellula nella locomozione. Sono delle estensioni cellulari transitorie che possono essere classificate in vari modi a seconda delle forme e delle caratteristiche. I filopodi, per esempio, sono sottili, come delle antenne, dei prolungamenti con i quali la cellula “sente”, esplora lo spazio. I lamellipodi invece sono più larghi e caratterizzati da strutture di adesione al substrato che permettono l’ancoraggio della parte anteriore della cellula che può così tirarsi dietro tutto il resto del corpo durante lo scivolamento in avanti.
​
PO4
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML): mantenute per 7 giorni in ambiente ricco in fosfati (PO4) e quindi con fenotipo osteogenico o calcificato.
Cellule trattate con mezzo calcificante per 7 giorni. Aspetto simile alle ON prese singolarmente, ma tendono a formare aggregati e crescono meno che le ON.
​
In alcune patologie, le CML sintetiche, attivate da specifici fattori (Nox5, Ca2+ citosolico, ROS) possono modificare ulteriormente il loro fenotipo e assumere quello “calcificato”, ricco di depositi minerali.
La calcificazione vascolare è un processo patogenico associato all'età che si manifesta in circa il 90% degli uomini e il 67% delle donne di età superiore ai 70 anni e si caratterizza per la deposizione di cristalli di calcio all’interno della parete di un vaso sanguigno sotto forma di microcalcificazioni. Insorge maggiormente a livello delle arterie coronarie nel cuore predisponendo all’infarto del miocardio. E’ inoltre associata alla formazione di placche aterosclerotiche che bloccano il flusso sanguigno e alla loro rottura che può essere causa di eventi acuti come la trombosi e l’ictus.
Da una osservazione qualitativa utilizzando sempre DAPI e Falloidina come marcatori generici osserviamo che le cellule muscolari mantenute in ambiente ricco di fosfati e calcio per almeno 7 giorni cambiano ancora il loro aspetto, in parte perdono l’adesione al substrato e si staccano, si concentrano in alcune zone della piastra costituendo delle specie di isolotti, tendono ad allungarsi e molte muoiono.
​
PO4+Q
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML): mantenute in ambiente calcificante ma con l’aggiunta di Quercetina
Cellule trattate per 7 giorni con mezzo calcificante ma con aggiunta di Quercetina come anti-calcificante. Crescono moltissimo fino a costituire uno strato continuo.
​
Attualmente non ci sono trattamenti medici in grado di bloccare o far revertire il meccanismo di calcificazione vascolare. Sembrerebbe possibile, in parte, prevenire questo processo integrando la dieta con prodotti naturali quali Quercetina, Resveratrolo, magnesio e Curcumina. È stato infatti osservato che l’utilizzo di questi nutraceutici inibisce e rallenta la calcificazione in modelli di studio animali.
Abbiamo allora provato a fornire alle CML coltivate in condizioni calcificanti Quercetina e in effetti abbiamo potuto verificare che questo integratore contrasta gli effetti nocivi del mezzo calcificante; le cellule si dividono più velocemente, non si staccano e crescono molto meglio andando a formare uno strato uniforme e ordinato molto simile a quello che possiamo vedere nei tessuti muscolari.
​
Microscopio confocale - immagini singole
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML)
Il seguente modello è ottenuto mediante elaborazione di una singola immagine al microscopio confocale. Il testo è stata realizzato per verificare la possibilità di usare solo un'immagine derivante dal microscopio andando a ridurre la complessità delle operazioni di elaborazione.
​
Microscopio a fluorescenza - immagini singole
Cellule muscolari lisce di arteria coronarica (CML)
Il seguenti modelli sono ottenuti mediante elaborazione di una singola immagine al microscopio a fluorescenza. Rispetto al microscopio confocale, il microscopio a fluorescenza restituisce immagini di minor qualità. D'altra parte il minor costo di tale strumento lo rende molto più diffuso e di più semplice utilizzo rispetto al microscopio confocale.
​